流式细胞仪标本制备的原理及步骤

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。流式细胞仪标本制备的原理：活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

一、实验材料：细胞样品

二、试剂、试剂盒：兔血清、第二抗体、单克隆抗体、FCS-RPMI1640 DPBS

三、仪器、耗材：玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜

四、流式细胞仪标本的制备具体步骤：

1、收集细胞。上皮细胞需要蛋白酶消化，然后收集。加PBS或者流式洗液1ml，振荡，1400rpm离心5min，弃上清。

2、染表型悬浮细胞于100ul体积，细胞浓度约为或者小于1X10^6，加入流式染色抗体。按照说明书用量或者减半（根据经验），分出一管作为同型。

3、4℃，避光30min，用PBS洗一遍，1400rpm离心5min，弃上清。

4、破膜破膜剂以BDpharmingen破膜剂为例，加300ul，4℃，避光30min以现配的破膜洗液1ml洗一遍。1400rpm离心5min，弃上清。

5、胞内染色加入流式抗体4℃，避光30min。用破膜洗液1ml洗一遍，1400rpm离心5min，弃上清。

6、加入200ul1～2％多聚甲醛4℃避光保存。一般情况下，可直接把抗体加入到弃上清后的残留液里（体积大概为50ul左右）。

五、流式细胞仪标本制备注意事项：

1、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaNO3，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落；

2、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性；

3、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4、细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

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